人結締組織活化肽ⅢELISA檢測試劑盒（酶聯免疫吸附試驗法）使用說明書
僅供科研實驗研究使用，嚴禁用于臨床診斷!
l本試劑盒用于體外定量檢測血清、血漿、組織勻漿及相關液體樣本中人結締組織活化肽ⅢELISA檢測試劑盒
l有效期：6個月
l保存條件：2-8℃
[實驗原理]
試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯免疫吸附試驗（ELISA）。往預先包被人結締組織活化肽Ⅲ（CTAPⅢ）捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體，經過溫育并徹底洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的 人結締組織活化肽Ⅲ（CTAPⅢ） 呈正相關。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計算樣品濃度。
[樣本處理及要求]
1. 血清：將收集于血清分離管的全血標本在室溫放置2小時或4℃過夜，然后1000×g離心20 分鐘，取上清即可，或將上清置于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
2. 血漿：用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標本，并將標本在采集后的30分鐘內于2-8℃ 1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測，或將上清置于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
3. 組織勻漿：用預冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細胞會影響測量結果），稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應體積的PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應9mL的PBS，具體體積可根據實驗需要適當調整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進一步裂解組織細胞，可以對勻漿液進行超聲破碎，或反復凍融。最后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，取上清檢測。
4. 細胞培養物上清或其它生物標本：請1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測，或將上清置于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
注：標本溶血會影響最后檢測結果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。
[需要而未提供的試劑和器材]
1.酶標儀（450nm）
2.高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
3.37℃恒溫箱
4.蒸餾水或去離子水
[試劑盒組成]
備注：
1. 標準品濃度依次為：12、6、3、1.5、0.75、0.375 ng/mL
2. 經過大量正常標本檢驗，標本的正常濃度值均在試劑盒提供的檢測范圍內，實驗過程中直接取50μL樣本上樣即可。當有部分樣本值超過標準品濃度時，可用樣本稀釋液將標本進行適當稀釋后再進行實驗。
[注意事項]
1）試劑應按標簽說明書儲存，使用前恢復到室溫。稀稀過后的標準品應丟棄，不可保存。
2）實驗中不用的板條應立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質。
3）不用的其它試劑應包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質前使用。
4）使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A、B液時，避免使用帶金屬部分的加樣器。
5）使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。
6）洗滌酶標板時應充分拍干，不要將吸水紙直接放入酶標反應孔中吸水。
7）底物A應揮發，避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下。避免用手接觸，有毒。實驗完成后應立即讀取OD值。
8）加入試劑的順序應一致，以保證所有反應板孔溫育的時間一樣。
9）按照說明書中標明的時間、加液的量及順序進行溫育操作。
[試劑準備]
試劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平衡后方可使用。
20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即1份20×洗滌緩沖液加19份蒸餾水。
[操作步驟]
1）使用前，將所有試劑充分混勻。不要使液體產生大量的泡沫，以免加樣時加入大量的氣泡，產生加樣上的誤差。
2）根據待測樣品數量加上標準品的數量決定所需的板條數。每個標準品和空白孔建議做復孔。每個樣品根據自己的數量來定，能使用復孔的盡量做復孔。標本用標本稀釋液1：1稀釋后加入50ul于反應孔內。
3）加入稀釋好后的標準品50ul于反應孔、加入待測樣品50ul于反應孔內。立即加入50ul的生物素標記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育1小時。
4）甩去孔內液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復此操作3次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數增加一次。
5）每孔加入80ul的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30分鐘。
6）甩去孔內液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復此操作3次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數增加一次。
7）每孔加入底物A、B各50ul，輕輕振蕩混勻，37℃溫育10分鐘。避免光照。
8）取出酶標板，迅速加入50ul終止液，加入終止液后應立即測定結果。
9）在450nm波長處測定各孔的OD值。
[實驗結果計算]
以所測標準品的OD值為橫坐標，標準品的濃度值為縱坐標，在坐標紙上或用相關軟件繪制標準曲線，并得到直線回歸方程，將樣品的OD值代入方程，計算出樣品的濃度。
[試劑盒性能]
1. 檢測范圍：0.375 ng/mL – 12 ng/mL。
2. 靈敏度：檢測濃度小于0.1 ng/mL。
3. 特異性：不與其它可溶性結構類似物交叉反應。
4. 重復性：板內變異系數小于10% ，板間變異系數小于15% 。
